Szybko coraz szybciej - sekwencjonowanie z zastosowaniem odwracalnych terminatorów07.04.2010

autor: Jakub Barylski
słowa kluczowe: RNA, DNA, test, diagnostyka, sekwencjonowanie

Choć nie tak szybko jak wielu się spodziewało, lecz nieubłaganie zbliża się era, w której każdy pozna sekwencję swojego osobistego genomu. Wszystko to dzięki nowym  technikom sekwencjonowania. W numerze trzynastym IGM pojawił się już tekst o pirosekwencjonowaniu [1]. Nie jest to jednak jedyna nowość na rynku. Niedawno w Polsce pojawiły się metody sekwencjonowania oparte na wykorzystaniu tzw. odwracalnych terminatorów. Są to ( podobnie jak klasyczna metoda dideoksy Sangera) techniki oparte na syntezie nowej cząsteczki DNA komplementarnej do sekwencjonowanej matrycy. Wykorzystują jednak pomysł syntezy nowo powstającej cząstki "po jednym nukleotydzie". Najbardziej rozpowszechnioną techniką z tej grupy jest metoda Solexa firmy Illumina. W skrócie jej przebieg przedstawia się następująco:

  • przygotowanie próby i trawienie DNA na małe (~200 pz) fragmenty
  • unieruchomienie cząsteczek DNA w komorze reakcyjnej
  • amplifikacja i tworzenie "klonalnych plamek" wielu kopii danego odcinka
  • usuwanie po jednej  z nici (zawsze tej samej) z każdej dwuniciowej cząsteczki przez cięcie nukleolityczne, denaturację i odpłukanie z komory reakcyjnej
  • synteza sekwencji komplementarnej do powstałej matrycy "po jednym  nukleotydzie" (usyskuje się ten efekt przez przyłączanie znakowanych fluorescencyjnie 3'-O-azydometylopochodnych trifosforanów deoksyrybonukleozydów - zablokowanie przez podstawnik grupy 3' hydroksylowej uniemożliwia kontynuowanie syntezy)
  • detekcja sygnału fluorescencyjnego z każdej plamki
  • usunięcie fluorochromu i odblokowanie grupy 3' hydroksylowej
  • kolejne rundy wydłużania, detekcji sygnału oraz odblokowywania 3' końca syntezowanej cząsteczki aż do końca reakcji
  • komputerowa obróbka danych i składanie sekwencji z fragmentów

Dzięki tej technice czas sekwencjonowania całego genomu stał się znacznie krótszy. Umożliwia ona również sekwencjonowanie całego transkryptomu (RNA) po przepisaniu go na cDNA. Co więcej możliwe jest oszacowanie względnej ilości kopii danej sekwencji, co jest bardzo istotne w przypadku badań ekspresji genów. Choć na razie jest to jeszcze metoda dość kosztowna, to i tak w wielu przypadkach tańsza niż podejście klasyczne.  Trzeba też pamiętać, że to dopiero początek rozwoju tej technologii [2].

Metoda firmy Illumina nie jest  jedyną opartą na wykorzystaniu odwracalnych terminatorów. Istnieje  np. podobna technika firmy Helicos, pomijająca krok amplifikacji, i sekwencjonująca nawet pojedyncze cząstki DNA [3]. Można więc przypuszczać, że konkurencja przyspieszy rozwój tych technologii i obniży ich ceny.

Literatura:

  1. Szatkowska  K; BŁYSKawiczne Sekwencjonowanie; IGM Internetowa Gazeta Medyczna; 12.2009; http://hylostet.pl/igm/article/87; 03.03.2009 
  2. Bentley DR et al.; Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.; Nature.; 2008
  3. Helicos BioSciences Corporation; http://www.helicosbio.com/; 03.03.2009

ISSN 1689-7730