PCR – najpopularniejsza metoda badania DNA07.02.2009

autor: Jakub Barylski
słowa kluczowe: DNA, test, Real-time PCR, PCR, diagnostyka, biotechnologia

probówka PCR, w tle termocykler służący do cykliczej zmiany temperatury

U lekarza, w gazetach a nawet w filmach kryminalnych można usłyszeć o możliwości czy potrzebie wykonania testów genetycznych czy badań DNA. Na czym jednak one polegają, i w jaki sposób są wykonywane? Otóż badanie DNA najczęściej oznacza jakąś odmianę reakcji PCR (ang. Polymerase Chain Reaction). Jest to najczęściej wykorzystywana w diagnostyce metoda badania kwasów nukleinowych, dlatego właśnie ona będzie tematem tego artykułu.

1. Mechanizm reakcji PCR


Technika PCR pozwala na szybkie powielenie wybranego fragmentu DNA, a następnie określenie jego długości. Za jej pomocą można także stwierdzić czy poszukiwana sekwencja w ogóle znajduje się w próbce. Aby to osiągnąć trzeba zacząć od zaprojektowania dwóch krótkich odcinków DNA zwanych starterami. Odcinki te musza być komplementarne do sekwencji oskrzydlających fragment, który chcemy powielić (patrz ryc. 1.1.). Następnie do badanej próbki dodaje się substraty do syntezy DNA (trifosforany deoksyrybonukleozydów), enzym zdolny do jej przeprowadzania (termostabilną polimerazę DNA) odpowiedni bufor (roztwór utrzymujący stałe pH) oraz wcześniej wspomniane startery. Powstała mieszanina umieszczana jest w tak zwanym termocyklerze. Jest to maszyna zdolna poddawać mieszaninę cyklicznym zmianom temperatury. Na początku reakcji podgrzewa ona próbkę, aby rozpleść dwuniciową cząsteczkę DNA. Potem schładza ją do temperatury, w której do odpowiedniej nici mogą przyłączyć się startery. Następnie próbka jest ponownie ogrzewana, tym razem jedynie do temperatury, w której najlepiej działa termostabilna polimeraza DNA. W tym momencie rozpoczyna się wydłużanie startera. W ten sposób tworzą się odcinki o sekwencji komplementarnej do badanego DNA i zaczynające się od startera. Następnie cały cykl zmian temperatury powtarza się określoną ilość razy, tak by uzyskać odpowiednią ilość produktu. Warunkiem zajścia reakcji jest komplementarność starterów do DNA znajdującego się w próbce. Po zakończeniu reakcji produkt lub produkty (gdyż często celowo lub przez przypadek otrzymujemy więcej niż jeden produkt) rozdzielane są elektroforetycznie w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, co pozwala na ustalenie ich długości.

działanie metody PCR (polymerase chain reaction)

Ryc 1. Etapy cyklu podczas reakcji PCR: A – denaturacja, B - hybrydyzacja starterów, C oraz D wydłużanie starterów przez polimerazę DNA, E – Koniec elongacji (powstały produkty cyklu).

2. Odmiany techniki PCR

Istnieją liczne odmiany tej techniki pozwalające np. na wykrywanie konkretnych zmian w DNA, jak również RNA, czy określenie ilości kopii danego odcinka DNA w próbce. Forma tego artykułu pozwala na przedstawienie jedynie niektórych z nich.

Technika PCR – RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism) pozwala na przykład odkryć niektóre mutacje w interesującej nas sekwencji DNA. Po namnożeniu odpowiedniego fragmentu (np. genu, którego mutacja wywołuje jakąś chorobę), trawi się go za pomocą tak zwanych enzymów restrykcyjnych. Są to białka, które rozpoznają, a następnie przecinają określoną krótką sekwencję. Jeśli w obrębie takiej sekwencji nastąpi zmiana (mutacja) - miejsce cięcia zniknie i uwidoczni się to we wzorze prążków, powstałych po rozdziale produktów reakcji PCR – RFLP w żelu. Może się również zdarzyć, że w skutek mutacji powstaną nowe miejsca restrykcyjne, co również uwidoczni się za pomocą tej metody.

Na zmianę sekwencji wskazuje zmiana struktury przestrzennej cząsteczki DNA. Zależność tą wykorzystuje technika SSCP (ang. Single Strand Conformation Polymorphism). Produkt reakcji PCR poddaje się w jej trakcie denaturacji (rozdzieleniu nici komplementarnych). Następnie obu niciom pozwala się ułożyć we właściwe dla swojej sekwencji struktury przestrzenne, po czym rozdziela się je w żelu. Dzięki temu można często rozróżnić np. normalny i zmutowany allel genu.

Przy odpowiednio ustalonych warunkach reakcji produkt będzie powstawał jedynie gdy startery będą idealnie komplementarne. Jeśli więc zaprojektuje się startery przyłączające się do DNA w miejscu, w którym może występować interesująca nas mutacja to w zależności od tego czy ona rzeczywiście się tam znajduje - otrzymamy produkt lub nie. Technikę tą nazywa się ASA (ang. Allele-specific amplification).

Znaną mutację można wykryć również wykorzystując podczas reakcji PCR trzy startery (jeden na sekwencję „normalną” jeden na zmienioną oraz starter przeciwny). W takiej sytuacji startery konkurują o miejsce przyłączenia się do DNA, a konkurencję tę „wygrywa” starter o większej zgodności sekwencji z miejscem docelowym. Technikę tą nazywa się COP-PCR (ang. Competitive Oligonucleotide Priming – Polymerase Chain Reaction).

Powielenie RNA umożliwia technika RT – PCR (ang. Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction). Polega ona na przepisaniu badanego RNA na DNA za pomocą enzymu – odwrotnej transkryptazy. Tak otrzymany odcinek określa się jako cDNA. Może on dalej być powielony jak podczas zwykłej reakcji PCR. Technika RT – PCR jest szczególnie przydatna w diagnostyce chorób wirusowych gdyż wiele wirusów ma genomy zbudowane z RNA.

Skrót RT – PCR jest niekiedy używany także w odniesieniu do innej techniki Real Time PCR. Jest to metoda pozwalająca uzyskać dane o ilości badanego DNA (lub RNA, jeśli połączy się ją z techniką opisaną powyżej). Jest to możliwe dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych, które reagują zmianami w emisji światła w zależności od ilości produktu w mieszaninie reakcyjnej.

W diagnostyce i badaniach populacyjnych wykorzystuje się markery PCR sprzężone z wybranymi chorobami. Oznacza to, że nie bada się sekwencji DNA wywołującej chorobę, lecz sekwencje położone blisko niej i razem z nią się dziedziczące. Cysto korzysta się z markerów RAPD (ang. Random Amplification of Polymorphic DNA) otrzymanych z amplifikacji odcinków DNA znajdujących się pomiędzy losowo położonymi starterami.

3. Przykłady wykorzystania w diagnostyce chorób człowieka

Z pomocą reakcji PCR opracowano testy wykrywające obecność wirusów np. wirusa HIV, wirusa opryszczki (HSV), czy kojarzonego powszechnie ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka szyjki macicy - ludzkiego wirusa brodawczaka [1, 2, 3]. Również obecność wielu bakterii można wykryć za pomocą tej techniki. Molekularne markery PCR, pozwalające wykryć i zidentyfikować bakterię, zostały zaprojektowane np. dla powodującej boreliozę Borrelia burgdorferi, przenoszonej przez zwierzęta i atakującej ludzki układ pokarmowy pałeczki Yersinia enterocolitica czy niezwykle groźnych szczepów Staphylococcus aureus (gronkowca złocistego), zwanych MRSA (ang. Methicyllin-resistant Staphylococcus aureus czyli metycylino – oporny gronkowiec złocisty)[4, 5, 6,]. Dzięki badaniom opartym na tej metodzie można również sprawdzić czy dany szczep Escherichia coli posiada gen konieczny do syntezy groźnej dla człowiek termolabilnej toksyny [7]. W połączeniu z sekwencjonowaniem technika PCR umożliwia identyfikacje większości znanych bakterii (na podstawie sekwencji 16S rRNA). Najbardziej oczywistym zastosowaniem tej techniki jest jednak diagnoza chorób genetycznych. Można dzięki niej diagnozować np. mukowiscydozę, pląsawicę Huntingtona i wiele innych [8, 9]. Znanych jest również wiele markerów pozwalających stwierdzić podwyższone ryzyko wielu schorzeń, w tym nowotworów czy chorób układu krążenia. Co więcej diagnostyka chorób genetycznych możliwa jest już w okresie ciąży, a w przypadku zapłodnienia in vitro nawet przed zagnieżdżeniem się blastocysty w ścianie macicy [10]. Jest to możliwe gdyż da się namnożyć wybrany odcinek DNA korzystając jedynie z materiału pochodzącego z jednej komórki a pobranie jej z zarodka nie powoduje zakłóceń w jego rozwoju.

Literatura

  1. Ratcliff RM, Chang G, Kok T, Sloots TP; Molecular Diagnosis of Medical Viruses; Current Issues in Molecular Biology; 2007 Jul; 9(2)
  2. Franzen-Röhl E, Tiveljung-Lindell A, Grillner L, Aurelius E; Increased detection rate in diagnosis of herpes simplex virus type 2 meningitis by real-time PCR using cerebrospinal fluid samples; Journal of Clinical Microbiology; 2007 Aug; 45(8)
  3. Castle PE, Porras C, Quint WG, Rodriguez AC, Schiffman M, Gravitt PE, González P, Katki HA, Silva S, Freer E, Van Doorn LJ, Jiménez S, Herrero R, Hildesheim A; CVT Group.Comparison of two PCR-based human papillomavirus genotyping methods. Journal of Clinical Microbiology; 2008 Oct; 46(10):3437-45.
  4. Sławomir Czernecki Borelioza - choroba kontrowersyjna. Zarys problemu. IGM Internetowa Gazeta Medyczna Grudzień (czasopismo internetowe); 2008 Dec; http://hylostet.pl/igm/article/16/; 2009 Feb 1
  5. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, Yao JD, Wengenack NL, Rosenblatt JE, Cockerill FR 3rd, Smith TF; Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing; Journal of Clinical Microbiology; 2006 Jan; 19(1)
  6. Sen K; Rapid identification of Yersinia enterocolitica in blood by the 5' nuclease PCR assay; Journal of Clinical Microbiology; 2000 May; 38(5)
  7. Trindade PA, McCulloch JA, Oliveira GA, Mamizuka EM; Molecular techniques for MRSA typing: current issues and perspectives; The Brazilian journal of infectious diseases; 2003 Feb; 7(1)
  8. Reischl U, Youssef MT, Wolf H, Hyytia-Trees E, Strockbine NA; Real-time fluorescence PCR assays for detection and characterization of heat-labile I and heat-stable I enterotoxin genes from enterotoxigenic Escherichia coli; Journal of Clinical Microbiology; 2004 Sep; 42(9)
  9. Avner R, Laufer N, Safran A, Kerem BS, Friedmann A, Mitrani-Rosenbaum S; Preimplantation diagnosis of cystic fibrosis by simultaneous detection of the W1282X and delta F508 mutations, Human Reproduction; 1994 Sep; 9(9)
  10. Margolis RL, Ross CA; Diagnosis of Huntington disease; Clinical Chemistry; 2003 Oct;49(10)
  11. Lissens W, Sermon K; Preimplantation genetic diagnosis: current status and new developments; Human Reproduction; 1997 Aug;12(8)

Być może zainteresują Cię również inne artykuły poświęcone diagnostyce molekularnej: ELISA, Real- time PCR, Western blot Mikromacierze. Polecamy również artykuł o Pirosekwencjonowaniu, oraz MRI- technice obrazowej wykorzystującej Rezonans Magnetyczny.

ISSN 1689-7730