Zastosowania real-time PCR07.04.2009

autor: Katarzyna Szatkowska
słowa kluczowe: DNA, genetyka, Real-time PCR, PCR

Real-time PCR

Real-time PCR stał się w ostatnich latach jednym z głównych narzędzi detekcji kwasów nukleinowych oraz ich ilościowego pomiaru. Zarówno w badaniach naukowych jak i rutynowej diagnostyce.

Technika ilościowego PCR

Real-time PCR, bądź po polsku „reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym” to czuła metoda analityczna pozwalająca na zamplifikowanie wybranego odcinka DNA, czyli powielenie in vitro fragmentu DNA flankowanego dwoma starterami przez termostabilną polimerazę DNA w obecności jonów magnezu i trifosforanów nukleozydów, przy jednoczesnym pomiarze ilości produktu dzięki wykorzystaniu technik fluorescencyjnych.
W tym celu znakuje się startery, sondy oligonukleotydowe lub powielane fragmenty fluorochromami i mierzy poziom emitowanej przez nie fluorescencji za pomocą spektrofluorymetru sprzężonego ze specjalnie przystosowanym do tego celu termocyklerem. Silniejsza fluorescencja oznacza więcej kopii DNA. Metoda real-time jest nie tylko jakościowa, ale również ilościowa (stąd wymiennie stosowany skrót qPCR- ang. quantitative PCR). Pozwala na oszacowanie początkowej ilości cząsteczek DNA, co nie jest możliwe przy zastosowaniu konwencjonalnego PCR.

Profilowanie ekspresji genów

Ponieważ ilość określonego mRNA w danej komórce zależy od poziomu ekspresji odpowiedniego genu, po przepisaniu mRNA na cDNA za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy i jego późniejszej amplifikacji za pomocą real-time PCR możliwa jest analiza ekspresji genów. Technika ta pozwala m.in określić jak zmienia się synteza białek po potraktowaniu określonym czynnikiem np. lekiem, a także zanotować zmiany dokonujące się na poziomie transkryptomu (jest to zestaw cząsteczek mRNA dla danego organizmu, organu lub tkanki w określonych stanach fizjologicznych czy patologicznych). Pomiar może zostać dokonany w sposób względny, w stosunku do genu o stałej ekspresji, tzw. genu referencyjnego (ang. housekeeping gene). Otrzymany wynik wskazuje wtedy ile razy ekspresja badanego genu jest silniejsza/słabsza od ekspresji genu referencyjnego. Można go porównać z analogiczną wartością zmierzoną dla np. zdrowej tkanki i dzięki temu ustalić lub wykluczyć chorobę.
Oszacowanie rzeczywistej, bezwzględnej ilości kopii genu jest zadaniem trudniejszym. By tego dokonać należy posłużyć się próbką ze znaną ilością kopii interesującego nas genu, sporządzić serię rozcieńczeń a następnie krzywą wzorcową. Nieznane próbki są wtedy porównywane z ową krzywą w celu bezwzględnego ilościowego oznaczenia.
Pomiaru ilościowego dokonuje się np. by sprawdzić poziom ekspresji transgenu przy pracach nad modyfikacjami genetycznymi organizmów.

Walidacja metody mikromacierzowej

Real-time PCR stosuje się również w celu walidacji wyników uzyskanych za pomocą mikromacierzy DNA, czyli innej metody badania ekspresji genów (nawet kilkudziesięciu tysięcy jednocześnie). Są to płytki z naniesionymi sekwencjami DNA – sondami, do których hybrydyzują komplementarne nici cDNA wyznakowane fluorescencyjnie. Ponieważ technika ta posiada pewne niedoskonalości warto potwierdzić otrzymane rezultaty ilościowym PCR.

Analiza mutacji

Real time PCR nadaje się również do analizy mutacji, np. typu SNP (ang. single nucleotide polimorphism) - polimorfizmu pojedynczego nukleotydu, często zastępując sekwencjonowanie (droższe), test SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism, polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA) czy RFLP (ang. restriction fragment-length polymorphism, polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych).
Poszukiwaniu pojedynczych zmian nukleotydowych służy metoda HRM (ang. high resolution melting) polegająca na analizie krzywych topnienia DNA. By taką krzywą wykreślić, zaraz po zamplifikowaniu pożadanej sekwencji podnosi się temperaturę z ok. 50ºC do 95ºC i monitoruje poziom fluorescencji. Stosując znaczniki wiążące się do dwuniciowego DNA można zarejestrować temperaturę w której nici denaturują. Jest to temperatura charakterystyczna dla określonej sekwencji nukleotydów. Gdy ulega ona zmianie, czyli w przypadku mutacji, krzywa topnienia ma nieco inny przebieg niż krzywa otrzymana dla fragmentu prawidłowego.

Diagnostyka onkologiczna

Identyfikacja specyficznych sekwencji DNA jest także wykorzystywana w onkologii. Real-time PCR pozwala na detekcję translokacji chromosomowych (np. translokacja t(14;18) jako marker choroby resztkowej w chłoniaku grudkowym) i innych zmian materiału genetycznego. Ma też zastosowanie w badaniach podstawowych procesu onkogenezy oraz konstrukcji leków przeciwnowotworowych, gdyż umożliwia wizualizację odpowiedzi komórek poddanych testowanej terapii.

Diagnostyka mikrobiologiczna

Real-time PCR jest również niezwykle istotnym narzędziem diagnostyki mikrobiologicznej. Umożliwia wykrywanie patogenów bardzo krótko po zakażeniu, a także tych które są trudne w hodowlach. Szybka detekcja mikroorganizmu pozwala na podjęcie natychmiastowego, i co ważne, właściwego leczenia. Można tym samym ograniczyć nadużywanie antybiotyków o szerokim spektrum i zapobiec lekooporności mikroorganizmów. W chwili obecnej dostępny jest już komercyjnie szybki test „SeptiFast” firmy Roche Diagnostics, umożliwiający identyfikację 25 gatunków bakterii i grzybów, odpowiedzialnych za 90% zakażeń krwi. Można tego dokonać w mniej niż 6 h. dysponując jedynie 1,5 ml próbki. Starsze metody diagnostyczne polegające na wykonaniu posiewu krwi dają wynik po upływie kilku dni. Dla wielu pacjentów to zbyt długo (szczególnie w przypadku sepsy).

Przyszłość

Potrzeba analizy małych ilości kwasów nukleinowych pozwala przypuszczać, że metoda real-time PCR będzie się dalej rozwijała. Może znaleźć zastosowanie  w  przemyśle spożywczym i rolnictwie do identyfikacji pasożytów, mikroorganizmów i genetycznie zmodyfikowanych organizmów. Ponadto, coraz częściej wskazuje się potencjalne aplikacje w kryminalistyce.

Nie tylko pomiar DNA - immune qPCR

Jak wynika z przytoczonych przykładów real-time PCR jest stosowany do rozmaitych analiz kwasów nukleinowych. Ale może on również służyć do ilościowego oznaczania białek. Technika ta nazywa się „immune qPCR” (ryc.1) i oferowana jest przez firmę Chimera Biotech. Przypomina nieco tzw. test sandwich ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay,  test immunoenzymatyczny). Przeciwciało immobilizuje się na płytce do PCR a następnie dodaje testowany roztwór. Dochodzi do związania antygenu (czyli analizowanego białka) z unieruchomioną immunoglobuliną. W kolejnym etapie wprowadza się przeciwciało drugorzędowe wykazujące powinowactwo do antygenu, sprzężone z fragmentem DNA (tzw. DNA-tag). Teraz należy jedynie wykonać ilościowy PCR. Ilość białka jest proporcjonalna do zmierzonego sygnału fluorescencji. Przewagą opisanego testu nad tradycyjnym testem ELISA jest jego większa czułość. Umożliwia np. bardzo wczesne wykrycie wirusa HIV, a dokładnie jednego z jego białek – białka p24.

porównanie immunoPCR i testu ELISA
Ryc. 1. Porównanie testu ELISA (po prawej) z immunoPCR. B – analizowane białko, E- enzym sprzężony z przeciwciałem drugorzędowym.

Wady i zalety

Technika real time PCR zyskała w ostatnim czasie dużą popularność właśnie ze względu na jej czułość (wykrycie poniżej pięciu kopii genu w komórce) i specyficzność. Nie wymaga dużej ilości materiału (np. biopsyjnego czy uzyskanego metodą laserową), a przeprowadzenie testu zajmuje stosunkowo mało czasu. Ma jednak również swoje wady. Należą do nich: wysoki koszt sprzętu, łatwość kontaminacji próbek a także zdarzające się problemy z powtarzalnością wyników w przypadku analizy ilościowej. Kontaminację można praktycznie wyeliminować poprzez przestrzeganie standardów wykonania badania jak i standardów GLP.

Literatura:

  1. Barylski J.; PCR – najpopularniejsza metoda badania DNA: IGM Internetowa Gazeta Medyczna (2009) 3

  2. Bustin S A; Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems; Journal of Molecular Endocrinology (2002) 29, 23–39.

  3. Kubista M; Emerging real-time PCR applications; Drug Discovery World; Summer (2008): 57-66.
  4. Mackey I M, Arden K E, Nitsche A; Real-time PCR in virology; Nucleic Acid Research (2002); 30 (6): 1292-1305

  5. Marisa L, Medrano W & J Real-time PCR for mRNA quantitation; BioTechniques (2005); 39 (1)

  6. Mark A, Repa V & J J; The power of real-time PCR; Adv Physiol Educ(2005) 29: 151–159

Być może zainteresują Cię również inne artykuły poświęcone diagnostyce molekularnej:  Western blot, ELISA, Mikromacierze. Polecamy również artykuł o Pirosekwencjonowaniu, oraz MRI- technice obrazowej wykorzystującej Rezonans Magnetyczny. Przeczytaj również artykuły o: boreliozie, wągliku, bakteriach w terapii nowotworów.

ISSN 1689-7730