Mikromacierze– nowoczesna metoda diagnostyczna07.06.2009

autor: Tomasz Woźniak
słowa kluczowe: RNA, DNA, test, diagnostyka, mikromacierze

mikromacierz i zapałka

Zdjęcie mikromacierzy, dzięki uprzejmości Centrum Badań DNA w Poznaniu.

Wstęp

Diagnostyka cały czas podlega dużym zmianom. Pojawienie się wielu nowych metod wywodzących się z biochemii i biotechnologii spowodowało, że możemy wykrywać u pacjentów poszczególne mutacje genów, analizować tkankę guza, czy wykrywać obecność patogenów we krwi, analizując ich materiał genetyczny lub wykrywając skierowane przeciw nim przeciwciała. Metody te jednak pozwalają na analizę niewielkiej liczby czynników wpływających na ludzkie zdrowie. Stosunkowo niedawno wprowadzono metodę, która pozwala na jednoczesne monitorowanie ekspresji wielu genów – badanie z użyciem mikromacierzy.

W ogólnym zarysie technologia mikromacierzy opiera się o wykrywanie wyizolowanego mRNA (matrycowe RNA) z badanej linii komórkowej za pomocą macierzy do której przyczepione jest setki tysięcy cząsteczek DNA [1]. Cząsteczki DNA o różnych sekwencjach są unieruchomione na specjalnie przygotowanej płytce w charakterystyczny sposób umożliwiający automatyczny odczyt. Cząsteczki pochodzące z badanej tkanki są przepisywane na cDNA (za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy) oraz znakowane fluorescencyjnie. Jeśli w badanej próbce znajdują się sekwencje mRNA komplementarne do sekwencji DNA znajdujących się w danym miejscu mikromacierzy, to obydwie cząsteczki hybrydyzują (łączą się ze sobą). Następnie odmywa się niezwiązane cząsteczki kwasu nukleinowego po czym dokonuje odczytu fluorescencji. Ponieważ ilość cząsteczek danego mRNA odzwierciedla poziom ekspresji danego białka, za pomocą tej techniki można porównywać jak wykorzystywana jest informacja genetyczna w chorych i zdrowych tkankach lub badać różnice między tkankami lub przedstawicielami różnych gatunków.

 

Technika

Powstał szereg metod opartych o mikromacierze, jednak najpowszechniej wykorzystuje się dwa systemy: mikromacierze cDNA (ang. cDNA microarrays) oraz mikromacierze wysokiej gęstości (ang. high-density oligonucleotide microarrays).

W pierwszym podejściu wykorzystuje się DNA powstałe w reakcji PCR na matrycach cDNA. Następnie unieruchamia się je na płytce szklanej lub membranie nylonowej w ściśle określonych punktach o wielkości 100-300 mikrometrów [1]. Badany RNA poddaje się przepisaniu na cDNA (odwrotna transkrypcja), następnie fluorescencyjnie znakuje, hybrydyzuje z DNA immobilizowanym na płytce po czym następuje skanowanie i zbieranie danych. W technice tej wykorzystuje się dwa barwniki fluorescencyjne, najczęściej są to Cy3 i Cy5. Każdym z barwników znakuje się DNA z innej puli, dzięki czemu na jednej płytce można porównywać ze sobą dwie tkanki i analizować różnice w ekspresji poszczególnych genów. Informacje o hybrydyzacji uzyskuje się za pomocą skanera optycznego zapisującego fluorescencję dla każdego punktu mikromacierzy.

W drugim podejściu używa się krótkich oligomerów DNA o długości 20 – 25 reszt nukleotydów, nanoszonych na podłoże technologią ink-jet lub za pomocą fotolitografii na krzemowych płytkach przypominających swoją strukturą powierzchnię wafla lub nanoszonych na płytki szklane. Dla każdego genu wybierane jest 16-20 takich oligomerów. Badane mRNA podobnie jak w przypadku technologii cDNA microarray poddaje się „przepisaniu” na cDNA, jednak w tym przypadku powstają dwuniciowe cząsteczki cDNA, zawierające miejsce startu dla polimerazy T7. Na ich bazie przeprowadza się transkrypcję in vitro cząsteczek cRNA. W tym procesie włączane są nukleotydy znakowane biotyną, dzięki czemu cząsteczki cRNA będą mogły być wykryte na mikromacierzy. Następnie następuje skanowanie i analiza wyników. W technice mikromacierzy wysokiej gęstości jako referencję wykorzystuje się dane z identycznej mikromacierzy, do której hybrydyzowany był materiał z tkanki odniesienia. W przypadku obu technik po związaniu cząsteczek odpłukuje się niezwiązany materiał, aby wyeliminować sygnały od wyznakowanego i niezwiązanego RNA.

 

Przetwarzanie wyników.

Po analizie mikromacierzowej dysponujemy danymi w postaci intensywności poszczególnych sygnałów. Aby móc je wykorzystać należy je najpierw przetworzyć. Najpierw odejmuje się wartość sygnału tła. W tym celu można wykorzystać najbliższe otoczenie danego punktu, by jak najdokładniej obliczyć różnice. Kolejnym etapem jest normalizacja danych- usunięcie możliwych zaburzeń intensywności sygnałów. Przykładowo można zwielokrotnić niektóre z punktów, a następnie obliczając ich intensywność obliczyć względne intensywności sygnałów w różnych częściach mikromacierzy. Następnie oszacowuje się jakość wyników dla całej mikromacierzy oraz poszczególnych jej punktów. Kolejnym krokiem jest wykrycie różnic w ekspresji genów oraz ich pogrupowanie, które pozwoli na wyciągnięcie wniosków [2].

Wady i problemy

Jedną z głównych wad mikromacierzy jest problem mRNA jako wyznacznika procesów komórkowych. Wiele genów jest regulowanych potranskrypcyjnie i potranslacyjnie, co powoduje, że mikromacierze nie spełniają swojej roli w ich analizie [1]. Ważnym czynnikiem jest sama próba odniesienia. W przypadku analizy tkanki zmienionej chorobowo- najlepiej jest porównywać ją z tkanką niezmienioną, dzięki czemu można zaobserwować wzrost lub spadek intensywności sygnałów, pochodzących między innymi od kluczowych w rozwoju choroby genów. W niektórych przypadkach istotne są też takie czynniki jak np. faza cyklu komórkowego, w związku z czym należy dokładnie przemyśleć eksperyment. W przypadku porównywania intensywności sygnału pochodzącego od cząsteczek znakowanych dwoma barwnikami pojawia się dodatkowy błąd związany z potencjalną różnicą w sile niespecyficznego wiązania. Na wartości intensywności wpływ też ma lokalna gęstość poszczególnych RNA oraz etap odpłukiwania niezwiąznanego materiału, podczas którego cząsteczki oddyfundowują z różną intensywnością.

Kolejnym problemem jest pojawianie się fałszywie pozytywnych sygnałów. Ich obecność można jednak łatwo wyeliminować poprzez zwielokrotnienie pojedynczego punktu na mikromacierzy [1]. Ponadto w przypadku mikromacierzy cDNA może występować różna intensywność znakowania za pomocą różnych fluoroforów. Efekt ten można usunąć powtarzając eksperyment przy równoczesnej zamianie fluoroforów. Bezpośrednie porównywanie intensywności sygnałów wiąże się też z potencjalnym błędem związanym z różną siłą wiązania w przypadku różnych cząsteczek.

Metody zwiększania czułości.

Istnieje kilka metod zwiększania czułości mikromacierzy. Wykorzystują one techniki polegające na zwiększeniu wydajności transkrypcji w technice mikoromacierzy wysokiej gęstości, łączeniu jej z produkcją cDNA lub wykorzystaniu silnie znakowanych fluoroforem przeciwciał, by wzmocnić sygnał [1].

Zastosowania

Mikromacierze mają potencjalnie wiele zastosowań. W biologii molekularnej mogą służyć do analiz międzygatunkowych, analiz dotyczących poszczególnych szlaków metabolicznych lub szlaków przekazywania sygnałów w komórce (np. w przypadku wyłączenia jednego z genów metodą knock-out), wykrywania różnic w funkcjonowaniu tkanek i narządów na poziomie molekularnym, analiz związanych z promotorami genów, wykrywaniem możliwych funkcji nowo odkrytych genów [1], wykrywania jednonukleotydowych mutacji (ang. SNP Single Nucleotide Polymorphism) [3] a nawet do ustalania struktury drugorzędowej RNA [4]. Dzięki dużej ilości jednocześnie analizowanych informacji mogą okazać się wydajniejszym i szybszym narzędziem do analizy zmian ekspresji setek lub tysięcy genów jednocześnie, co wcześniej było nieosiągalne dla badaczy.

W medycynie mikromacierze stosuje się głównie w celu diagnozowania takich chorób jak choroby nowotworowe, wirusowe lub genetyczne, na przykład raka piersi, jajnika, talasemii, retinopatii czy infekcji wirusem HIV. Dokładna analiza może również pomóc wykryć różnice w przebiegu chorób i zdefiniować ich podtypy, stanowiąc krok naprzód w kierunku zindywidualizowanej medycyny. Ponadto wykrycie zmian w ekspresji poszczególnych genów pomaga wytypować potencjalne cele dla chemio- lub immunoterapii [1].

Co ciekawe, mikromacierze znalazły również zastosowanie w przeciwdziałaniu bioterroryzmowi. Wysoka czułość, mała objętość próbki oraz jednoczesna analiza wielu danych pozwoliły na wykorzystanie ich nie tylko w celu wykrycia  patogenów takich jak Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Yersinia pestis, wirus ospy prawdziwej czy wirus Ebola, ale również na ich profilowanie, charakteryzowanie, analizę nowo nabytych cech oraz typowanie potencjalnych kandydatów na leki. W tym przypadku mikromacierze mają nieco inną formę niż opisana powyżej, gdyż wykorzystuje się mikromacierze na których przebiega reakcja PCR, wiązanie patogenu do unieruchomionych przeciwciał,  albo są to mikromacierze z unieruchomionymi małymi cząsteczkami organicznymi służące do profilowania patogenu lub znalezienia potencjalnego leku [5].


W Polsce pierwszą firmą, która wprowadziła technologię mikromacierzy w swoją ofertę jest Centrum Badań DNA w Pozaniu.

Literatura

  1. Schulze A, Downward J; Navigating gene expression using microarrays — a technology review; Nature Cell Biology; 2001; E190:E195(3)
  2. Smyth G.K., Yang Y.H., Terry Speed T.;Statistical Issues in cDNA Microarray Data Analysis; Functional Genomics: Methods and Protocols
  3. Chagovetz A, Blair S; Real-time DNA microarrays: reality check; Biochemical Society Transactions; 2009; 471:475(37)
  4. Kierzek E, Kierzek R. Turner DH, Catrina IE; Facilitating RNA structure with microarrays; Biochemistry; 2006; 45(2):581-93 
  5. Uttamchandani M, Neo JL, Ong BNZ, Moochhala S; Applications of microarrays in pathogen detection and biodefence; Trends in Biotechnology; 2008;  53(27):61


Być może zainteresują Cię również inne artykuły poświęcone diagnostyce molekularnej: ELISA, PCR, Real- time PCR, Western blot lub wywiad z prezesem CB DNA- Michałem Kaszubą.

ISSN 1689-7730