Sleeping Beauty- historia odkrycia07.06.2009

autor: lek. Sebastian Woźniak
Zakład Immunologii Nowotworów WCO w Poznaniu, Oddział Chemioterapii WCO w Poznaniu
słowa kluczowe: DNA, terapia genowa, transpozon, Sleeping Beauty

Sleeping Beauty sekwencja

Ryc. Fragment genu transpozazy (Identyfikator GenBank: DD100289.1)

Odkąd udało się poznać budowę DNA i zrozumiano znaczenie istnienia genów, człowiek stara się wykorzystać tę wiedzę w służbie medycyny. Od lat naukowcy na całym świecie starają się wdrożyć różne formy terapii genowej. Podstawowym założeniem tej formy leczenia jest identyfikacja genu, którego wykorzystanie pozwoli zlikwidować objawy choroby, wprowadzenie go do właściwych komórek i wywołanie jego ekspresji. Obecnie znamy setki chorób uwarunkowanych genetycznie i wiemy jakie geny mogą je skorygować. Opracowano również wiele metod wprowadzania genów terapeutycznych do komórek i uzyskania ich stabilnej ekspresji. Wąskim gardłem jest jednak nadal niska wydajność tych procesów. Najbezpieczniejsze metody transformacji komórek należą do grupy metod niewirusowych. Jednak wykazują one równocześnie niską wydajność i tylko przejściową ekspresję wprowadzonego genu. Aby to zmienić część naukowców postanowiła bliżej przyjrzeć się naturze i procesowi ewolucji.

     W DNA występują specyficzne fragmenty łańcucha nukleotydowego zdolne do przenoszenia się z jednego miejsca genomu w drugie (transpozycji). Zostały one nazwane transpozonami, a enzym biorący udział w tym procesie– tranpozazą. Szacuje się, że blisko 45% materiału genetycznego człowieka to transpozony. Nie oznacza to jednak, że nasze geny bezustannie skaczą sobie z miejsca na miejsce. Dzięki istnieniu transpozonów geny kodujące białka o różnych funkcjach rozdzielały się lub łączyły w obrębie genomu. Pozwoliło to na powstawanie coraz większych i bardziej skomplikowanych struktur białkowych. Jednakże im bardziej skomplikowany był genom danego organizmu, tym bardziej obecność mobilnych elementów w DNA zaczynała szkodzić, zamiast przynosić korzyści. Największe szanse przetrwania miały te organizmy, które utraciły geny kodujące transpozazę. Bez tego enzymu transpozon nie mógł dalej się przemieszczać, co sprawiało, że genom takiego organizmu był bardziej stabilny. Mówimy, że te transpozazy zostały „wyłączone” w procesie pionowej inaktywacji (ang. vertical inactivation). Same transpozony jednak przetrwały w wyniku poziomego przekazywania genów (ang. horizontal gene transmission) pomiędzy gatunkami. W toku ewolucji w ich budowie następowały drobne lub znaczne zmiany powodowane różnego rodzaju mutacjami. Odtworzenie pierwotnej budowy transpozaz jest w większości przypadków niemożliwe.

     Obecnie znane transpozony podzielono na dwie grupy:

  • Transpozony autonomiczne– zawierają w swoim wnętrzu gen kodujący transpozazę. Jego ekspresja powoduje dalsze przenoszenie się transpozonu w obrębie genomu.
  • Transpozony nieautonomiczne– zawierają zmutowany gen transpozazy. W sekwencjach IR (ang. inverted repeats– odwrócone powtórzenia) mogą posiadać elementy sprzyjające mobilizacji transpozonu w obecności komplementarnej transpozazy.


     W genomie kręgowców nie znaleziono transpozonów autonomicznych. Ponadto stwierdzono, że transpozony nieautonomiczne przeniesione między różnymi gatunkami są nieaktywne, gdyż wymagają gatunkowo specyficznych czynników. Jednakże znaleziono wyjątek od tej reguły. Jest nim rodzina transpozonów określana mianem Tc1/mariner. Odkryto, że przedstawiciele tej rodziny występują w wielu organizmach– od E. coli do człowieka. Mogą być przenoszone między różnymi gatunkami i zachowują aktywność. W toku ewolucji przestała jednak istnieć transpozaza zdolna do ich przenoszenia. [1,2]

     Pewna grupa naukowców postanowiła odtworzyć brakującą transpozazę w sposób sztuczny. Wykonali analizę filogenetyczną wszystkich zmutowanych kopii genu dla transpozazy w rodzinie ryb łososiowatych. Porównując ze sobą te sekwencje, metodą prób i błędów odtworzyli oryginalną sekwencję i odkryli mechanizm działania tego enzymu. Pozwoliło to w dalszych badaniach poznać budowę jaką powinien mieć transpozon i stworzyć transpozonowy system transferu genów Sleeping Beauty. Została wybrana taka nazwa, gdyż analogia do Śpiącej Królewny w historii tego odkrycia narzuca się sama.

     Sleeping Beauty powołano do życia w 1997 roku. [1] Już w 2004 roku był dostępny gotowy system oparty na tej transpozazie. Składał się on z genu kodującego transpozazę oraz transpozonu ze specyficznie skonstruowanymi sekwencjami IR, odpowiadającymi za współdziałanie z tą właśnie transpozazą. Obie te sekwencje można umieścić na jednym plazmidzie (system cis), lub na dwóch oddzielnych plazmidach (system trans). [3] W kolejnych latach udoskonalano powyższą metodę uzyskując „hiperaktywną transpozazę” o wydajności 100 razy wyższej niż ta posiadana przez transpozazę pierwszej generacji. [4]

     Do podstawowych zalet tego systemu należą: integracja z genomem komórki jednej kopii ściśle określonego genu, jego stabilność i długa ekspresja. Częstość integracji z genomem jest 100-500 razy wyższa niż w innych systemach, co może być zasługą obecności w genie transpozazy sekwencji lokalizacji jądrowej (ang. nuclear localization signal, NLS). Wielkość transpozonu nie jest niczym ograniczona (jednakże od wielkości plazmidu zależy możliwość wprowadzenia go do komórki). System jest całkowicie syntetyczny, a więc nie spowoduje przenoszenia transpozonów już występujących w genomie człowieka. Ponadto jest to system binarny– dostępny w wersji cis i trans. [3]

     Dzięki odkryciach opublikowanych w czerwcowym wydaniu Nature genetics system ten może być punktem wyjścia dla bezpiecznej terapii genowej wielu chorób człowieka. [4]

Autor jest pracownikiem Zakładu Diagnostyki i Immunologii Nowotworów,

Wielkopolskie Centrum Onkologii, ul. Garbary 15,  61-866 Poznań

Literatura:

  1. Ivics Z i in. „Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transpozon from fish, and its transposition in human cells.” Cell, Vol. 91, 501-510, November 14, 1997
  2. Ivics Z I in. “The Sleeping Beauty transposable element: evolution, regulation and genetic applications.” Curr. Issues Mol. Biol. (2004) 6: 43-56
  3. Hackett PB i in. “Sleeping Beauty Transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.” 2004; Non-Viral vectors for gene therapy, 2nd edition.
  4. Mátés et al., “Molecular evolution of a novel hyperactive sleeping beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.” Nature Genetics; Jun2009, Vol. 41 Issue 6, p753-761

ISSN 1689-7730