Rozmowa z prezesem Centrum Badań DNA – Michałem Kaszubą o mikromacierzach DNA - technologii od niedawna dostępnej dla każdego Polaka07.06.2009

autor: Katarzyna Szatkowska
słowa kluczowe: DNA, mikromacierze, wywiad

Centrum Badań DNA to firma założona w 2006 r. na terenie Poznańskiego Parku Naukowo-Technicznego. Specjalizuje się w prowadzeniu badań genetycznych i analizach DNA. Zajmuje się diagnostyką infekcji, określaniem predyspozycji genetycznych, a także identyfikacją osobniczą, czyli ustaleniem pokrewieństwa oraz badaniem śladów biologicznych.

Michał Kaszuba – prezes CBDNA, biotechnolog, absolwent Uniwersytetu Warmińsko - Mazurskiego w Olsztynie

07.05.2009
Rozmawiała Katarzyna Szatkowska

Katarzyna Szatkowska: CBDNA wprowadziło niedawno testy diagnostyczne chorób i predyspozycji genetycznych w oparciu o innowacyjną technologię mikromacierzy. Na czym ona polega?

Michał Kaszuba: Mikromacierz DNA to płytka plastikowa lub szklana, na której umieszczone są fragmenty genów, które chcemy zbadać. Znajdują się tam wszystkie możliwe kombinacje różnych znanych nam mutacji, mogących predysponować do danej jednostki chorobowej, np. raka, mukowiscydozy, wrodzonego niedosłuchu czy jakiejkolwiek innej choroby. Fragmenty te porównujemy z DNA badanej osoby. Jeśli pacjent posiada mutację w genie, który sprawdzamy, to niosący ją odcinek DNA przyłączy się do płytki (na zasadzie komplementarności par zasad) i da nam sygnał świetlny, co można odczytać przy pomocy specjalnego urządzenia. Ponieważ widzimy w którym miejscu kwasy nukleinowe zhybrydyzowały, wiemy w związku z tym, jaka występuje u danej osoby mutacja.

KS: Metoda ta została opracowana już jakiś czas temu. Na czym polega zatem innowacyjność badania?

MK: CBDNA jest pierwszą firmą w Polsce, która komercyjnie oferuje tego rodzaju testy. Wcześniej korzystały z nich jedynie ośrodki naukowe. My chcemy wprowadzić je do rutynowej praktyki laboratoryjnej. Dlatego też nawiązaliśmy współpracę z estońską firmą ASPER Biotech, która opracowała i opatentowała technologię APEX microarray, umożliwiającą badanie setek fragmentów DNA i występujących w nich mutacji w jednym eksperymencie. Coraz więcej wiemy na temat wpływu różnych genów i ich dysfunkcji na etiologię różnych chorób, przede wszystkim wrodzonych. Okazuje się, że podłoże wielu z nich jest bardzo złożone. Często dana choroba, np. rak piersi, nie jest powodowana mutacją w pojedynczym genie (to byłoby bardzo proste do zbadania), ale mogą odpowiadać za nią zmiany w wielu genach. Analiza wszystkich za pomocą tradycyjnego sekwencjonowania czy PCR byłaby poważnym projektem badawczym, wymagającym znacznych nakładów finansowych.

KS: Jakie choroby pozwalają identyfikować oferowane przez Pana firmę testy?

MK: W tej chwili oferujemy 16 różnych testów. Są to przed wszystkim testy na rzadkie choroby wrodzone, takie jak wrodzony niedosłuch czy wrodzony zanik wzroku. Ponadto Centrum Badań DNA za pomocą techniki mikromacierzy jest w stanie zidentyfikować 88 różnych mutacji w 6 genach predysponujących do raka piersi i jajnika. W podstawowym screeningu analizuje się jedynie kilka mutacji, m.in. BRCA1 i BRCA2, standardowymi metodami. Są to rzeczywiście najczęstsze mutacje, odpowiadające za większość przypadków raka piersi czy jajnika, ale nie za wszystkie. W ofercie mamy także panel na mukowiscydozę, który wykrywa 254 mutacje (w tej chwili standardowo bada się od 24 do 37). Poza tym diagnozujemy też talasemię, retinopatię, zespół Ushera i wiele innych chorób.

KS: Jakie są ograniczenia wykorzystywanej przez Państwo technologii mikromacierzy?

MK: To trudne pytanie, gdyż pozytywne aspekty zdecydowanie przeważają. Czułość tej metody jest bardzo wysoka, wykrywa się wszystkie mutacje, również w układach heterozygotycznych, czyli wystarczy mieć jedną kopię genu zmutowanego żeby ją zidentyfikować i tym samym wykazać nosicielstwo mutacji. Ograniczeniem tej metody jest jednak fakt, że musimy korzystać z dużych ilości DNA. Oznacza to, że bardzo trudne jest wykonanie badania z mikrośladów, np. z włosa czy z prostego wymazu, ponieważ po prostu jest tam za mało DNA.

KS: Z czego w takim razie izoluje się DNA do badań?

MK: Z krwi. Pobiera się jej od 2 do 4 ml, czyli dosyć dużo jak na badanie molekularne, co może być czasem problematyczne. Metoda ta jest także dosyć trudna do zastosowania w badaniach screeningowych, ponieważ pojedyncza analiza wymaga sporego nakładu czasu i pracy.

KS: Jak wygląda opracowanie testu diagnostycznego? Państwo sami się tym zajmują czy robi to firma zewnętrzna?

MK: Oferowane przez nas testy są robione w technologii Apex Microarray, która została wymyślona, opracowana i opatentowana przez naukowców estońskich. My wprowadzamy ją na polski rynek i obecnie sprawdzamy czy istnieje zapotrzebowanie na rutynowe wykonywanie tego rodzaju testów w Polsce. Chcemy również dostosować testy do wymagań polskiej populacji. Jeśli uznamy, że określonej mutacji brakuje, wprowadzimy ją do mikromacierzy. Planujemy także opracowywać nowe mikromacierze wspólnie z Estończykami. W tej chwili pracujemy nad mikromacierzą do diagnostyki predyspozycji do raka jelita grubego.

KS: Czyli prowadzą państwo również badania własne?

MK: Tak, jak najbardziej. Jesteśmy firmą badawczo-rozwojową. Znaczną część naszych przychodów wydajemy na własne badania naukowe.

KS: W takim razie jakie jeszcze badania Państwo prowadzą?

MK: Nasze prace skupiają się na udoskonalaniu testów diagnostycznych, które oferujemy i wprowadzaniu nowych, bądź też walidacji klinicznej testów innych firm, które są dostępne na rynku. W tej chwili przymierzamy się do wdrożenia całego panelu testów do diagnostyki zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, które umożliwią szybkie ustalenie przyczyny infekcji. Zajmujemy się też nowotworami, np. związanym z nimi genem K-ras, który powinno się diagnozować w momencie podejmowania decyzji o chemioterapii, gdyż jego mutacja może determinować całkowitą nieskuteczność leczenia. Inną grupą chorób którą się zajmujemy są choroby odkleszczowe. Zaprojektowaliśmy własne testy, w technologii real-time PCR, do identyfikacji i ilościowego oznaczania niektórych patogenów przenoszonych przez kleszcze.

KS: Jakie zatem testy, w technologiach innych niż mikromacierze, znajdują się w ofercie CBDNA?

MK: Oferujemy cały szereg badań związanych z infekcjami różnych układów, w tym m.in. infekcje ogólnoustrojowe- mamy cały panel do diagnostyki sepsy, cały panel do diagnostyki chorób dróg oddechowych, jak również cały panel do diagnostyki infekcji dróg moczowo-płciowych (URO-GENITAL). Urogenital to panele testów, które powstały z myślą o kobietach będących w ciąży lub ją planujące. Wykrywają one najczęstsze zakażenia układu moczowo-płciowego, stanowiące największe zagrożenie dla kobiety w ciąży oraz jej dziecka przed, w trakcie i po porodzie. Panele URO-GENITAL pozwalają identyfikować aż do 21 patogenów podczas jednego badania. „URO-GENITAL 21” to największy tego typu panel w Polsce. Są to testy które wykonujemy w technologii DPO-multiplex PCR, czyli innowacyjnej modyfikacji standardowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

KS: DPO oznacza…?

MK: Dual Priming Oligonucleotide. Są to zmodyfikowane, długie (powyżej 30 nt) startery, które mają w środku linker z inozyny, sprawiający, że znaczne zwiększa się specyficzność reakcji. Czasem startery potrafią przyłączyć się do matrycy, nawet jeśli sekwencje nie są w 100% komplementarne. Pojawiają się wtedy produkty niespecyficzne czy smeary, co znacznie utrudnia interpretację wyniku. Technologia DPO całkowicie to eliminuje.

KS: W jaki sposób to działa? Jak eliminuje niespecyficzność?

MK: Primer podzielony jest na dwie części: krótszą od końca 3’ (przyp. red. tam gdzie przyłącza się polimeraza) i dłuższą od końca 5’. W środku znajduje się linker. Jeżeli jakikolwiek nukleotyd jest niesparowany to ten linker działa jak sprężynka, która nie pozwala się do końca przyłączyć drugiej części startera i w związku z tym nie zachodzi reakcja PCR. Primer musi być w 100% komplementarny do matrycy, aby zamplifikować sekwencję, co eliminuje fałszywie pozytywne wyniki.

Ponieważ nie pojawiają się produkty niespecyficzne, nie ma kompetycji starterów o produkty. Przez to znacznie zwiększa się czułość reakcji, nawet dziesięciokrotnie. Standardowa reakcja PCR ma czułość (LOD) ok. 100, a więc aby zidentyfikować danego patogena musimy mieć 100 kopii jego DNA. W przypadku DPO PCR ilość ta spada do 10, przy całkowicie zachowanej specyficzności. Technologia ta fantastycznie nadaje się do multipleksu, gdzie szukamy kilku drobnoustrojów w jednej reakcji. Różne startery nie są w stanie hybrydyzować między sobą, nie przyłączają się do matryc niespecyficznie i dają zawsze tylko jeden prążek.

Multipleksy umożliwiają nam bardzo szeroki screening. Często zdarza się, że objawy określonej infekcji nie są klasyczne, więc nie wiadomo jaki drobnoustrój jest za nią odpowiedzialny. Klasyczne metody diagnostyczne przewidują posiewy mikrobiologiczne. Jednakże klasyczna hodowla wielu patogenów jest bardzo trudna lub wręcz niemożliwa (np.: wirusy czy chlamydie). Przeprowadzając badanie techniką multipletx-PCR jesteśmy w stanie bez problemu wykryć czynnik sprawczy choroby. Przewagą testów molekularnych, poza tym, że identyfikują one szerszą gamę drobnoustrojów, jest też to, że lekarz może natychmiast podjąć decyzję o leczeniu, a dopiero potem zrobić badanie. W przypadku posiewu jest to niemożliwe, gdyż w momencie podania antybiotyku większość bakterii zginie i nie będzie mogła urosnąć w hodowli. Natomiast z martwej bakterii można wyizolować DNA i je oznaczyć.

KS: Widzę, że firma jest bardzo nowoczesna i rozwojowa. Jakie plany na przyszłość ma Centrum Badań DNA? Jakich kolejnych produktów możemy się spodziewać?

MK: Ponieważ współpracujemy z lekarzami, wiemy na jakie testy jest zapotrzebowanie. Będziemy rozszerzać niektóre z naszych paneli. Tak jak wspominałem przymierzamy się do wprowadzenia nowego panelu do diagnostyki zapalenia opon mózgowych, również w technologii DPO PCR.

KS: A jakie są perspektywy współpracy z zagranicą? Słyszałam o planach rozwijania kontaktów biznesowych z Brazylią…

MK: Tak, owszem. Wygraliśmy konkurs organizowany przez Urząd Marszałkowski w Poznaniu „I- Wielkopolska – Innowacyjni dla Wielkopolski”. Dzięki temu mogliśmy uczestniczyć w misji gospodarczej województwa wielkopolskiego do Brazylii. Okazało się, że Brazylia jest bardzo zainteresowana współpracą z nami, gdyż to co oferujemy w Poznaniu, u nich jest praktycznie niedostępne. Nawiązaliśmy więc kilka kontaktów, które staramy się rozwijać. Dotyczą one przede wszystkim mikromacierzy DNA, ale także diagnostyki kobiet w ciąży oraz ich dzieci.

KS: Życzę w takim razie owocnej współpracy, dalszych sukcesów i nieustannego rozwoju.

MK: Bardzo dziękuję za rozmowę.

Przeczytaj również artykuły o: boreliozie i PCR oraz wywiady z dr Marcinem Schmidtem temat znaczenia i przyszłości nutrigenomiki i z lek. med. Piotrem Kurkiewiczem na temat boreliozy.

ISSN 1689-7730