ELISA- badanie częstsze niż myślisz07.07.2009

autor: Jakub Barylski
słowa kluczowe: test, diagnostyka, przeciwciało, biotechnologia, ELISA

Ile w badanej próbce jest interesującego nas białka? Czy pacjent miał kontakt z danym drobnoustrojem? Czy w jego krwi występują przeciwciała charakterystyczne dla danej choroby autoimmunologicznej? Odpowiedzi na te pozornie niezwiązane ze sobą pytania może dostarczyć nam jeden test- ELISA.

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay– enzymatyczny test immunosorbcji) to właściwie nazwa licznej i często wykorzystywanej rodziny reakcji immunoenzymatycznych.

Podstawą działania tego testu jest wykorzystanie antygenu lub przeciwciała związanego z podłożem stałym oraz kompleksu przeciwciała sprzężonego z enzymem (najczęściej peroksydazą chrzanową, fosfatazą alkaliczną lub oksydazą glukozową). Kompleks taki można następnie wykryć za pomocą substratu dającego w kontakcie z enzymem barwny produkt. Można również zastosować związek, który podczas katalizowanej przez enzym reakcji emituje światło (ma właściwości fluorescencyjne) [1].

Gdy celem jest wykrycie białka (antygenu) lub pomiar jego stężenia w badanych próbach rozpocząć trzeba od związania z podłożem stałym odpowiedniego przeciwciała, skierowanego przeciwko danemu antygenowi. Wykonuje się to zwykle poprzez opłaszczanie dołków (studzienek) w specjalnych płytkach wspomnianym przeciwciałem. Następnie blokuje się możliwość niespecyficznego wiązania się antygenów do opłaszczonej studzienki inkubując w niej roztwór np. odpowiedniej albuminy czy odtłuszczonego mleka. Potem podaje się badaną próbę. Jeśli znajduje się w niej poszukiwane przez nas białko to ulegnie ono związaniu do przeciwciała. Niezwiązane pozostałości próby trzeba odpłukać po czym podaje się kolejne przeciwciało. Jest ono dobrane tak, aby wiązało się z badanym antygenem, lecz w innym miejscu jego struktury. Dzięki temu przeciwciała wzajemnie nie blokują swojego przyłączania. Jeśli z drugim przeciwciałem związany jest enzym można w tym momencie podać odpowiedni substrat i uwidocznić wynik reakcji. Reakcję tego typu określa się jako "kanapkowy test ELISA" (ang. sandwich ELISA) gdyż antygen znajduje się w trakcie jej trwania pomiędzy dwoma warstwami przeciwciał. Jej przebieg został schematycznie przedstawiony na rycinie 1.  

ELISA unieruchomione przeciwciało

Ryc 1. "Kanapkowy" test ELISA z wykorzystaniem  immobilizowanego przeciwciała A- wiązanie antygenu do unieruchomionego przeciwciała, B- wiązanie innego przeciwciała skierowanego przeciw temu samemu antygenowi związanego z enzymem, C- przeprowadzenie reakcji pozwalającej na detekcję antygenu, D- brak wiązania dla innych antygenów.

Sygnał  jaki daje działanie enzymu może być zbyt słaby, szczególnie jeśli badane białko nie osiąga w próbce odpowiedniego stężenia. Można go wzmocnić dodając kolejne przeciwciało, tym razem skierowane na drugie przeciwciało (nazywa się je przeciwciałem drugorzędowym w przeciwieństwie do pierwszorzędowego z którym się łączy). Mówi się wtedy o reakcji niebezpośredniej [1].

W innych wariantach testu ELISA z podłożem stałym związany jest antygen. Następnym krokiem ponownie jest blokowanie, a potem podanie badanej surowicy. Jeśli znajduje się w niej przeciwciało specyficznie oddziałujące z wspomnianym antygenem, nastąpi jego wiązanie. Po odpłukaniu niezwiązanych pozostałości surowicy można podać przeciwciało wiążące się do innych przeciwciał i związane z enzymem. W ten sposób można wykryć np. obecności przeciwciał skierowanych przeciw danemu wirusowi czy nawet antygenom własnego organizmu (w przypadku chorób autoimmunologicznych) w krwi pacjenta. Schemat takiego doświadczenia przedstawiono na ryc. 2. Również taką reakcję można przeprowadzić w sposób niebezpośredni  stosując kolejne przeciwciało w celu wzmocnienia sygnału [1].  

ELISA unieruchomiony antygen

Ryc 2. Test ELISA z wykorzystaniem immobilizowanego antygenu A- wiązanie przeciwciała do wcześniej unieruchomionego antygenu, B- wiązanie przeciwciała skierowanego przeciw pierwszemu przeciwciału, C- reakcja immunoenzymatyczna dzięki której wykrywane są antygeny.

Należy również wspomnieć o jeszcze jednej odmianie testu ELISA jaką jest ELISA kompetycyjna. W tej odmianie ilość badanego białka (antygenu lub przeciwciała) ustala się dzięki zastosowaniu czynnika współzawodniczącego z nim o miejsce wiązania. Jeśli na przykład celem doświadczenia jest poznanie ilości przeciwciała w surowicy oplaszczamy studzienkę antygenem a następnie podajemy mieszankę surowicy badanej (w której wedle naszych przypuszczeń znajduje się nie wyznakowane enzymem przeciwciało) oraz wyznakowanego przeciwciała monoklonalnego. W konsekwencji cały otrzymany sygnał pochodzi od przeciwciała rywalizującego z badanym o miejsce wiązania, a więc jego siła jest odwrotnie proporcjonalna do ilości przeciwciała w surowicy. Istnieje również analogiczna metoda umożliwiająca ustalenie ilości antygenu [1].

Test ELISA może być i jest stosowany w diagnostyce chorób wirusowych. Za jego pomocą można wykryć zakażenie takimi wirusami jak HIV, wirusy zapalenia wątroby typu B i C a także rozróżnić poszczególne serotypy wirusa grypy [2, 3]. Możliwe jest także wykrywanie zakażeń bakteryjnych spowodowanych np. Helicobacter pylori (związana z powstawaniem wrzodów żołądka) czy Treponema pallidum (krętka wywołującego kiłę) [4, 5]. Za pomocą testów ELISA da się również wykryć specyficzne przeciwciała związane z wystąpieniem chorób autoimmunologicznych jak na przykład autoimmunologiczne zapalenie wątroby czy reumatoidne zapalenie stawów [6, 7]. Okazuje się iż metoda ta znajduje zastosowanie również w diagnostyce nowotworów, co jest kolejnym dowodem na jej uniwersalność i użyteczność [8, 9].

Powiązane tematy:

Literatura:

  1. Voller A, Bartlett A, Bidwell DE; Molecular Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques; Journal of Clinical Pathology, 1978; 31
  2. Torane VP, Shastri JS; Comparison of ELISA and rapid screening tests for the diagnosis of HIV, hepatitis B and hepatitis C among healthy blood donors in a tertiary care hospital in Mumbai; Indian Journal of Medical Microbiology; 2008; 26(3)
  3. Prabakaran M, Ho HT, Prabhu N, Velumani S, Szyporta M, He F, Chan KP, Chen LM, Matsuoka Y, Donis RO, Kwang J; Development of epitope-blocking ELISA for universal detection of antibodies to human H5N1 influenza viruses; PloS one; 2009, 4(2)
  4. Kuo FC, Wang SW, Wu IC, Yu FJ, Yang YC, Wu JY, Wang WM, Wu DC; Evaluation of urine ELISA test for detecting Helicobacter pylori infection in Taiwan: a prospective study; World Journal of Gastroenterology; Sep 2005; 11(35)
  5. Espy MJ Wang LN, Zheng HY, Li J, Wang XF, Liu XR; Sensitivity and specificity of ELISA based on recombinant Treponema pallidum antigen and rapid plasma reagin test in diagnosis of syphilis: a comparative study; Zhonghua Yi Xue Za Zhi; Jun 2007; 87(24)
  6. Aubert V, Pisler IG, Spertini F; Improved diagnoses of autoimmune hepatitis using an anti-actin ELISA; Journal of clinical laboratory analysis; 2008; 22(5)
  7. Suzuki K, Sawada T, Murakami A, Matsui T, Tohma S, Nakazono K, Takemura M, Takasaki Y, Mimori T, Yamamoto K; High diagnostic performance of ELISA detection of antibodies to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis; Scandinavian Journal of Rheumatology; 2003; 32(4)
  8. Anborgh PH, Wilson SM, Tuck AB, Winquist E, Schmidt N, Hart R, Kon S, Maeda M, Uede T, Stitt LW, Chambers AF; New dual monoclonal ELISA for measuring plasma osteopontin as a biomarker associated with survival in prostate cancer: clinical validation and comparison of multiple ELISAs; Clinical Chemistry; May 2009; 55(5)
  9. Ding L, Zou XJ, Ao JE, Yao AX, Cai L; ELISA test to detect CDKN2A (p16(INK4a)) expression in exfoliative cells: a new screening tool for cervical cancer; Molecular Diagnosis & Therapy; 2008; 12(6)


Być może zainteresują Cię również inne artykuły poświęcone diagnostyce molekularnej: PCR, Real- time PCR, Western blot, Mikromacierze. Polecamy również artykuł o Pirosekwencjonowaniu, oraz MRI- technice obrazowej wykorzystującej zjawisko Rezonansu Magnetycznego, boreliozie, wągliku oraz bakteriach w terapii nowotworów.

ISSN 1689-7730