Katalityczne kwasy nukleinowe w leczeniu nowotworów07.08.2009

autor: Marcin Sajek
słowa kluczowe: nowotwór, RNA, DNA, leczenie, leki

W latach 80-tych odkryto, że kwasy nukleinowe (DNA i RNA) oprócz przenoszenia informacji genetycznej, podobnie jak enzymy mogą brać udział w reakcjach biochemicznych jako katalizator. Cząsteczki RNA pełniące taką funkcję nazwano rybozymami, a cząsteczki DNA- deoksyrybozymami, podkreślając w ten sposób podobieństwo do enzymów [1-4]. Cząsteczki te  postanowiono wykorzystać m.in. w celu zwalczania nowotworów.

W terapii nowotworów próbuje stosować się zarówno katalityczne cząsteczki DNA jak i RNA. Większość prowadzonych badań charakteryzuje się dużą skutecznością w fazie przedklinicznej. Niestety badania kliniczne dotyczące rybozymów często nie dają tak dobrych rezultatów jak badania z wykorzystaniem linii komórkowych czy zwierząt. żaden z testowanych terapeutyków nie przeszedł ich z sukcesem. Badania deoksyrybozymów są jeszcze w fazie przedklinicznej [5].

W przypadku przewlekłej białaczki szpikowej (CML), spowodowanej wadliwą translokacją genów, prowadzącą do powstania chromosomu typu Filadelfia, za pomocą deoksyrybozymów próbuje się hamować ekspresję genu fuzyjnego bcr-abl. Produktem genu bcr-abl są dwa patogenne mRNA (b2a2 i b3a2). Wewnątrzkomórkową aktywność deoksyrybozymów badano w specjalnej linii komórkowej HeLa. Do badań użyto konstrukt zawierający gen bcr-abl i gen reporterowy kodujący lucyferazę (jest to marker genetyczny- lucyferaza katalizuje reakcję utleniania lucyferyny, podczas której emitowane jest światło). Obserwowano hamowanie ekspresji genu lucyferazy w 99%. Aktywność deoksyrybozymów wykazano również w układach in vivo, badając ekspresję endogennego genu bcr-abl w komórkach pobranych od pacjentów z chroniczną białaczką szpikową (BV173, K562 i CD34+). W celu zwiększenia odporności na degradację nukleolityczną do cząsteczek deoksyrybozymów wprowadzono odpowiednie modyfikacje. Zastosowano tutaj modyfikację 2’-OMe dla końcowych nukleozydów albo zmieniono skrajne wiązania fosforanowe oligonukleotydu na wiązania tiofosforanowe (PS). Deoksyrybozymy 2’-OMe wykazywały wysoką specyficzność w inaktywacji ekspresji genu bcr-abl oraz wywoływały apoptozę (śmierć komórek według zapisanego w nich programu) komórek BV173. Deoksyrybozymy PS natomiast hamowały ekspresję zarówno genu bcr-abl jak i normalnego abl.

W niektórych komórkach nowotworowych obserwowana jest nadekspresja (zwiększona produkcja) izoformy α kinazy białkowej C (PKCα). Wykazano, że modyfikowany deoksyrybozym skutecznie, w ok. 80%, hamuje syntezę PKCα w komórkach T98G (komórki ludzkiego nowotworu mózgu) i proliferację nowotworowych komórek T47D DMS 273, THX i T98G. Modyfikacja cząsteczki deoksyrybozymu polegająca na wprowadzeniu wiązań tiofosforanowych do części rozpoznającej substrat i po każdym nukleozydzie pirymidynowym w centrum katalitycznym pozwoliła na zwiększenie stabilności deoksyrybozymu w ludzkim osoczu (T1/2=90h w porównaniu do 2h cząsteczki niezmodyfikowanej) i stosunkowo wysoką aktywność (kkat=0,01 min-1).    

Wykazano także wewnątrzkomórkową aktywność deoksyrybozymów skierowanych na mRNA białka c-myc, badając ich wpływ na proliferację szczurzych komórek mięśni gładkich (SMC). Najbardziej efektywny okazał się deoksyrybozym zawierający po 9 nukleotydów w ramionach wiążących substrat i stabilizowany przez modyfikację końcowego wiązania międzynukleotydowego do postaci 3’-3’.Powodował on zahamowanie proliferacji komórek SMC w 80%. Jest to pierwszy opisany w literaturze przypadek działania deoksyrybozymu w komórkach [4].

Deoksyrybozym Dz13 skierowany przeciwko sekwencji mRNA  czynnika transkrypcyjnego c-Jun okazał się skuteczny w hamowaniu rozwoju czerniaka u myszy. Bardzo szybki wzrost tego nowotworu związany jest z bardzo szybkim pojawianiem się gęstej sieci naczyń krwionośnych zaopatrujących guz w składniki odżywcze (angiogeneza). W powstawaniu nowych naczyń krwionośnych bierze udział białko c-Jun. U myszy chorych na czerniaka, którym podawano deoksyrybozym skierowany przeciwko sekwencji mRNA c-Jun zaobserwowano zahamowanie wzrostu nowotworu w ponad 60% przypadków. Efekt ten związany był ze znacznym zmniejszeniem się liczby naczyń krwionośnych „zasilających” komórki nowotworowe [6].

Podobne wyniki dostarczyły badania nad deoksyrybozymem „tnącym” mRNA czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEFGR), który także odgrywa ważną rolę w angiogenezie, a więc również w powstawaniu naczyń krwionośnych na powierzchni komórek nowotworowych. W tym przypadku myszom zostały wstrzyknięte komórki ludzkiego nowotworu piersi. U 75% myszy, którym podawano deoksyrybozym nastąpiło zahamowanie wzrostu  nowotworu [7].

W przypadku rybozymów na uwagę zasługuje angiozym (ANGIOZYME®) badany wspólnie przez firmy RPI i Chiron Corporation. Jest on skierowany na mRNA genu receptora o aktywności kinazy tyrozynowej (Flt-I), który rozpoznaje czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGFR). Angiozym w II fazie badań klinicznych testowany był u pacjentów z nowotworem sutka i okrężnicy. U 25% osób z późnymi formami nowotworów po półrocznym podawaniu rybozymu podskórnie zaobserwowano zahamowanie wzrostu nowotworu (dane z drugiej połowy 2003 roku). Obecnie próbuje się stosować angiozym z chemioterapią.

Rybozym o nazwie HERZYM® testowany był przez firmę MedizyneTM Pharmaceuticals. Jego działanie polega na degradacji mRNA ludzkiego receptora o aktywności kinazy tyrozynowej (HER-2), rozpoznającego czynnik wzrostu naskórka (EGFR). Nadekspresja HER-2 obserwowana jest w nowotworach piersi, jajnika, płuc, krwi i prostaty.

Podobnie jak deoksyrybozymy, rybozymy próbuje się wykorzystać do hamowania ekspresji fuzyjnego genu bcr-abl. Przykładem może być MAXIZYME®. Wprowadzany jest on do komórek za pomocą wektorów retrowirusowych pod kontrolą promotora tRNAVal. Zawiera tzw. ramie sensorowe, które po rozpoznaniu sekwencji miejsca splicingu mRNA genów bcr i abl wywołuje allosteryczny efekt tworzenia centrum katalitycznego rybozymu typu hammerhead i prowadzi do degradacji onkogennego mRNA. Rybozym ten można by wykorzystywać do oczyszczania komórek szpiku kostnego pobranych od pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową. „Oczyszczony” szpik można by następnie ponownie wszczepić pacjentowi [8].

MAXIZYME® próbuje się także wykorzystać do usuwania mRNA zmutowanej formy genu p53. Mutacja w 249 kodonie tego genu (AGG na AGT) występuje u około 50% ludzi chorych na raka wątroby. Ważne jest, że rybozym zaprojektowany dla sekwencji zmutowanej nie przecina prawidłowego mRNA p53. Na razie wykazano efektywność i specyficzność cięcia w warunkach in vitro [9].

Skonstruowano także rybozymy przecinające sekwencje mRNA telomerazy. W komórkach nowotworowych obserwowana jest bardzo wysoka ekspresja tego enzymu. Organizmem   modelowym były myszy chore na czerniaka. U zwierząt, którym za pomocą kationowych liposomów wprowadzono rybozym ekspresja telomerazy w komórkach nowotworowych zmniejszyła się o ok. 75%, co spowodowało znaczne zmniejszenie liczby przerzutów w stosunku do grupy kontrolnej [10].  

Niektóre chemioterapeutyki wykazujące wysoką efektywność w leczeniu nowotworów u zwierząt, są znacznie mniej skuteczne u ludzi. Przykładem mogą być leki z grupy chloroetylonitrozomoczników (CENU). Oporność na nie spowodowana jest obecnością czynników chroniących ludzkie komórki nowotworowe przed cytotoksycznymi efektami alkilacji DNA (np. O6-metyloguaninowa metylotransferaza DNA- MGMT). Ekspresja MGMT występuje w 80% ludzkich nowotworów. Zahamowanie ekspresji tego enzymu uwrażliwia ludzkie komórki nowotworowe na CENU. W sekwencji mRNA MGMT zlokalizowano trzy potencjalne miejsca cięcia dla rybozymów- nukleotydy 161, 178 i 212. Aktywność rybozymów degradujących mRNA MGMT wykazano w komórkach linii HeLa. Z komórek tej linii uzyskano klony ze stabilna ekspresją rybozymów i wrażliwością na CENU [11].

Rybozymy próbuje się również wykorzystać w leczeniu nowotworów mózgu. Przykładem może być rybozym typu hairpin zaprojektowany aby „przecinać” sekwencje mRNA receptora czynnika wzrostu naskórka (EGFR), w którego genie występuje delecja 801 pary zasad. (tzw. EGFRvIII). Taka zmutowana forma receptora występuje w ponad 50% glejaka wielopostaciowego. Testowano trzy wersje rybozymu, do dalszych badań wybrano jedną, oznaczoną symbolem sCYMV1. Rybozym ten ograniczał proliferację komórek glejaka linii U87MG-∆EGFR o 69%.

W wielu eksperymentach projektowano rybozymy skierowane przeciwko sekwencji mRNA czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), bądź jego receptora- c-met. W badaniach nad glejakiem do syntezy katalitycznego RNA użyto tzw. kasety ekspresyjnej U1. Zapewnia ona wyższą stabilność rybozymu oraz jego dostarczenie do jądra komórkowego. U myszy, którym do komórek nowotworowych wprowadzono kasetę U1 z sekwencją rybozymu nastąpiło zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych. Zaobserwowano także zmniejszoną angiogenezę (tworzenie nowych naczyń krwionośnych) oraz odblokowanie niektórych szlaków apoptozy (programowanej śmierci komórki) [12]. Podobne pozytywne wyniki uzyskano w przypadku nowotworu piersi (linia komórkowa MDA MB 231 oraz myszy) [13] i nowotworu prostaty (linie PC3-NL4, także u myszy) [14].

Katalityczne kwasy nukleinowe próbuje wykorzystać się również w leczeniu innych chorób, np. pląsawicy Huntingtona [4] i choroby Alzheimera [12]. Badania te są w różnym stopniu zaawansowane. Lista możliwych zastosowań rybozymów i deoksyrybozymów jest długa. Należy jednak pamiętać, że do tej pory nie ma na rynku leku opartego na katalitycznych kwasach nukleinowych i żaden z potencjalnych terapeutyków nie jest stosowany poza próbami klinicznymi.

Literatura:

  1. Kruger K., Grabowski P. J., Zaug A. J., Sands J., Gottschlig D. E., Cech T. R. (1982): Self-Splicing RNA: Autoexcision and Autocatalization of the Ribosomal RNA Intervening Sequence of Tetrahymena , Cell, 31, 147-157
  2. Koroniak H., Barciszewski J. (red.) (2002): Na pograniczu chemii i biologii, tom 5, Wydawnictwo Naukowe UAM
  3. Nawrot B. (2000): Selekcja kwasów nukleinowych, Wiadomości Chemiczne, 54, 616-636
  4. Nawrot B. (2002): Katalityczne DNA- deoksyrybozymy, Postępy biochemii, 48, 20-34
  5. Patil S. D., Rhodes D. G., Burgess D. J. (2005): DNA-based Therapeutics and DNA Delivery Systems: A Comprehensive Review, The AAPS Journal, 7, E61-E77
  6. Zhang G., Dass C. R., Sumithran E., Di Girolamo N., Sun L. Q., Khachigian L. M. (2004): Effect of Deoxyribozymes Targeting c-Jun on Solid Tumor Growth and Angiogenesis in Rodents, Journal of the National Cancer Institute, 96, 683-696
  7. Zhang L., Gasper W. J., Stass S. A., Ioffe O. B., Davis M. A., Mixson A. J. (2002): Angiogenic Inhibition Mediated by a DNAzyme That Targets Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, Cancer Research, 62, 5463-5469
  8. Antoszczyk S., Nawrot B. (2003): Rybozymy w medycynie, Biotechnologia, 61, 140-152
  9. Kong X. J., Song J. H., Lin J. S., Huang H. J., Wang N. X., Liu N. Z., Li B., Jin J. X. (2003): Maxizyme-mediated specific inhibition on mutant-type p53 in vitro, World Journal of Gastroenterology, 9, 1571-1575
  10. Nosrati M., Li S., Bagheri S., Ginzinger D., Blackburn E. H., Debs R. J., Kashani-Sabet M. (2004): Antitumor Activity of Systemically Delivered Ribozymes Targeting Murine Telomerase RNA, Clinical Cancer Research, 10, 4983-4990
  11. Zhang Q., Ohannesian D. W., Erickson L. C. (2004): Hammerhead Ribozyme-Mediated Sensitization of Human Tumor Cells after Treatment with 1,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 309, 506-514
  12. Tritz R., Habita C., Robbins J. M., Gomez G. G., Kruse C. A. (2005): Catalytic nucleic acid enzymes for the study and development of therapies in the central nervous system, Gene Therapy and Molecular Biology, 9, 89-106
  13. Jiang W. G., Grimshaw D., Martin T. A., Davies G., Parr C., Watkins G., Lane J., Abounader R., Laterra J., Mansel R. E. (2003): Reduction of Stromal Fibroblast-induced Mammary Tumor Growth, by Retroviral Ribozyme Transgenes to Hepatocyte Growth Factor and its Receptor, c-MET , Clinical Cancer Research, 9, 4274-4281
  14. Kim S. J., Johnson M., Koterba K., Herynk M. H., Uehara H., Gallick G. E. (2003): Reduced c-Met Expression by an Adenovirus Expressing a c-Met Ribozyme Inhibits  Tumorigenic Growth and Lymph Node Metastases of PC3-LN4 Prostate Tumor Cells in an Orthotopic Nude Mouse Model, , Clinical Cancer Research, 9, 5161-5170

Gorąco zachęcamy do przeczytania artykułów poświęconych takim zagadnieniom jak rak żołądka, rak płuca, rak piersi, nowotworowe komórki macierzyste, immunoterapia w terapii czerniaka, wirusoterapia w leczeniu nowotworów i wykorzystanie bakterii w zwalczaniu nowotworów.

ISSN 1689-7730