Technika Western blot i jej zastosowanie w diagnostyce07.09.2009

autor: Jakub Barylski
słowa kluczowe: test, diagnostyka, przeciwciało

W swoim poprzednim artykule opisywałem technikę wykrywania białek zwaną ELISA. Kontynuując wątek badań opartych na wykorzystaniu przeciwciał w tym numerze zajmę się kolejną ważną techniką diagnostyczną zwaną western blot (rzadziej nazywaną immunoblotingiem).
Określenia te oznaczają metodę detekcji konkretnych białek w homogenacie komórkowym lub ekstrakcie białkowym poprzez ich rozdział elektroforetyczny, unieruchomienie na membranie i wykorzystanie odpowiednich przeciwciał. Nazwa western blot (western ang. zachodni) powstała jako gra słów – nawiązanie do nazwy techniki Southern blot. Choć pochodziła ona od nazwiska twórcy (Southern - które w języku angielskim oznacza południowy) to kolejne techniki wykorzystujące transfer biopolimerów na membranę nazwano dodając do słowa blot (ang. plama, plamić, mazać) określenia kolejnych stron świata [1, 2].
Pierwszym etapem procedury jest uwolnienie białek komórkowych z preparatu. W tym celu stosuje się metody mechaniczne jak homogenizacje w moździerzu, odpowiednim homogenizatorze lub młynku oraz odpowiednie bufory zawierające detergenty (np. Triton X100 lub SDS) a także związki chelatujące jony (jak EDTA)[2, 3, 4]. Niekiedy zamiast wszystkich białek komórkowych bada się jedynie te pozyskane z błon lub wybranych frakcji organellowych. W tym celu przeprowadza się odpowiednie procedury ich izolacji. Uzyskane w ten sposób homogenaty lub ekstrakty białkowe są rozdzielane metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (zwykle w warunkach denaturujących w żelu zawierającym SDS)[3, 4]. Dzięki temu uzyskujemy rozdział wszystkich białek ekstraktu na podstawie ich masy cząsteczkowej. Następnym etapem jest ich transfer na odpowiednią membranę która wykonaną z nitrocelulozy lub PVDF (poli(fluorku winylidenu))[2, 3]. Niekiedy stosuje się tak zwany transfer kapilarny, umieszczając membranę pomiędzy żelem a stosem fragmentów bibuły, które zasysają płyn z żelu a wraz z nim białka. Alternatywna metoda nosi nazwę elektrotransferu i wykorzystuje pole elektryczne aby przenieść rozdzielone białka na membranę. Jakość transferu można sprawdzić barwiąc membranę barwnikiem Ponceau S lub Coomasie. Kolejnym krokiem jest tak zwane blokowanie, czyli zabezpieczenie membrany przed niespecyficznym wiązaniem się do niej przeciwciał. Efekt ten otrzymuje się przez inkubację w roztworze albuminy z surowicy wołowej lub odtłuszczonego mleka oraz detergentu Tween [2, 3]. Po zakończeniu blokowania można przystąpić do inkubacji membrany w roztworze przeciwciał. Zwykle stosuje się dwa przeciwciała. Pierwsze to tak zwane przeciwciało pierwszorzędowe, wiążące się specyficznie do poszukiwanego białka. Jego nadmiar należy usunąć przez odpłukanie odpowiednim buforem. Następnie podaje się roztwór drugiego przeciwciała, zwanego drugorzędowym (niekiedy wykonuje się przedtem powtórne blokowaniu niespecyficznych miejsc wiążących na membranie). Wiąże się ono z przeciwciałem pierwszorzędowym a samo jest znakowane co umożliwia jego detekcję (należy jednak wspomnieć, że możliwa jest także wyznakowanie i detekcja przeciwciała pierwszorzędowego, choć wariant taki stosuje się rzadziej). Elementem znakującym zwykle jest enzym katalizujący (po dodaniu odpowiedniego substratu) reakcję dającą efekt chemiluminescencji lub reakcję barwną. Przeciwciało może być również znakowane radioaktywnie lub barwnikiem fluorescencyjnym. W przypadku reakcji chemiluminescencyjnych i znakowania izotopami promieniotwórczymi wynik procedury można zaobserwować na odpowiedniej kliszy. Jeśli próba wyznakowana jest enzymem dającym efekt barwny to wynik ten jest widoczny bezpośrednio na membranie, natomiast wynik uzyskany przy użyciu fluorochromu można obserwować za pomocą odpowiedniego sensora (np. kamery CCD)[2, 3]. Należy wspomnieć, że często wykonuje się wariant tej techniki w którym bada się nie to czy dane białko znajduje się w badanym materiale, lecz czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała skierowane przeciwko antygenom związanym np. z poszukiwanym przez nas „zarazkiem” (przeciwciała z badanej surowicy traktuje się tu jako odpowiednik przeciwciał pierwszorzędowych).
Zarówno w nauce jak i medycynie metoda western blot szybko znalazła liczne zastosowania. Immunobloting stosuje się w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana przez krętka Borelia burgdorferi, gruźlica wywoływana przez prątki Mycobacterium tuberculosis. [5, 6, 7]. Technika ta może być również wykorzystywana w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki [8, 9, 10, 11]. Metodą western blot można również wykryć niektóre choroby pasożytnicze, jak wągrzyca spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego, a nawet choroby genetyczne, jak pewne formy niedokrwistości Fanconiego [12, 13 anemia]. Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest również zastosowanie tej techniki w diagnostyce nowotworów, co dowodzi niezwykłej użyteczności i wszechstronnych możliwości jej wykorzystania [14].

Bibliografia:

  1. Nick; Bitesize Bio: brain food for cell and molecular biologists: Southern, northern, western (and eastern?); http://bitesizebio.com/2008/07/09/southern-northern-western-and-eastern/;  02.09.2009
  2. Wikipedia, the free encyclopedia: Western blot; http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot; 02.09.2009
  3. Western blot protocols, troubleshooting, scientific resources and research articles for the research community and science students; www.westernblotting.org; 31.08.2009
  4. UC Davis – University  of California Department of Microbiology; micro.mic.ucdavis.edu/; 02.09.2009
  5. Zöller L, Cremer J, Faulde M; Western blot as a tool in the diagnosis of Lyme borreliosis; Electrophoresis; 09.1993
  6. Sławomir Czernecki; Borelioza - choroba kontrowersyjna. Zarys problemu; IGM Internetowa Gazeta Medyczna; 01.2009
  7. Rovatti E, Corradi MP, Amicosante M, Tartoni PL, Panini W, Ancora A, Cenci AM, Zucchi L, Monno L, Angarano G, Saltini C; Evaluation of a western blot serum test for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection; European Respiratory Journal; 02.1996
  8. Chan EL, Sidaway F, Horsman GB; A comparison of the Genie and western blot assays in confirmatory testing for HIV-1 antibody; Journal of Medical Microbiology; 03.1996
  9. Sudha T, Lakshmi V, Teja VD; Western blot profile in HIV infection; Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology; 9-10.2006
  10. He Q, Chong KH, Chng (sprawdź to nazwisko, bo chyba pominąłes jakąś litere) HH, Leung B, Ling AE, Wei T, Chan SW, Ooi EE, Kwang J; Development of a Western blot assay for detection of antibodies against coronavirus causing severe acute respiratory syndrome; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology; 03.2004
  11. Martins TB, Woolstenhulme RD, Jaskowski TD, Hill HR, Litwin CM; Comparison of four enzyme immunoassays with a western blot assay for the determination of type-specific antibodies to herpes simplex virus; American Journal of Clinical Pathology; 02.2001
  12. Villota GE, Gomez DI, Volcy M, Franco AF, Cardona EA, Isaza R, Sanzón F, Teale JM, Restrepo BI; Similar diagnostic performance for neurocysticercosis of three glycoprotein preparations from Taenia solium metacestodes; The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene; 03.2003
  13. Pilonetto DV, Pereira NF, Bitencourt MA, Magdalena NI, Vieira ER, Veiga LB, Cavalli IJ, Ribeiro RC, Pasquini R; FANCD2 Western blot as a diagnostic tool for Brazilian patients with Fanconi anemia; Brazilian Journal of Medical and Biological Research; 03.2009
  14. Streckfus C, Bigler L; The use of soluble, salivary c-erbB-2 for the detection and post-operative follow-up of breast cancer in women: the results of a five-year translational research study; Advances in Dental Research; 06.2005

Być może zainteresują Cię również inne artykuły poświęcone diagnostyce molekularnej: ELISA, PCR, Real- time PCR, Mikromacierze. Polecamy również artykuł o Pirosekwencjonowaniu, oraz MRI- technice obrazowej wykorzystującej Rezonans Magnetyczny, budzącej wiele kontrowersji boreliozie i niebezpiecznym wągliku.

ISSN 1689-7730