BŁYSKawiczne Sekwencjonowanie07.12.2009

autor: Katarzyna Szatkowska
słowa kluczowe: DNA, diagnostyka, sekwencjonowanie

Pirosekwencjonowanie jest stosunkowo nową technologią oznaczania sekwencji kwasów nukleinowych, opracowaną w 1996 w Royal Institute of Technology w Sztokholmie przez profesora Pal Nyren’a i jego ucznia ucznia Mostafa Ronaghi.

Metoda ta nazywana jest też sekwencjonowaniem przez syntezę (DNA) w czasie rzeczywistym. Bazuje na pomiarze ilości pirofosforanu (PPi), uwalnianego w momencie włączenia komplementarnej zasady do nowopowstającej nici. Detekcji dokonuje się pośrednio, poprzez rejestrację sygnału świetlnego. By było to możliwe, niezbędna jest seria reakcji enzymatycznych.

Co musi znaleźć się w mieszaninie reakcyjnej?

  • matryca – ssDNA (jednoniciowy DNA)
  • startery
  • dNTP (dodawane po kolei)

Substraty:

  • APS (adenozyno-5’-fosfosiarczan)
  • lucyferyna

Enzymy:

  • fragment Klenowa polimerazy DNA
  • ATP sulfurylaza
  • lucyferaza
  • apyraza

Zachodzące reakcje

1. Pierwszą zachodzącą reakcją jest polimeryzacja nici DNA mająca miejsce po dodaniu jednego z czterech trifosforanów nukleozydów (dNTP). Jeżeli jest on komplementarny do matrycy, jednocześnie uwalniany jest pirofosforan. Reakcję katalizuje fragment Klenowa polimerazy DNA I.

(DNA)n + dNTP -> (DNA)n+1 + PPi

   2. Z powstałego pirofosforanu i dodanego do reakcji adenozyno-5’-fosfosiarczanu (APS) powstaje ATP. Przekształcenie katalizuje sulfurylaza ATP.

PPi  + APS -> ATP + H2SO4

      Ponieważ ATP jest jednym z pośrednich produktów reakcji, zamiast dATP dodaje się do mieszaniny dATPαS.

3. ATP jest substratem dla lucyferazy, która odpowiada za utlenienie lucyferyny do oksylucyferyny. Ta z kolei emituje strumień fotonów (hν)- jest to tzw. chemiluminescencja.

ATP + lucyferyna + O2 -> AMP + PPi + oksylucyferyna + CO2 + hν 

Światło rejestrowane jest przez kamerę CCD w postaci serii pików, zwanej pirogramem. Wysokość piku wskazuje na ilość wbudowanych nukleotydów tego samego rodzaju. Jeśli wprowadzony do mieszaniny reakcyjnej trifosforan nukleozydu nie jest komplementarny do matrycy, nie następuje jego włączenie do nowo syntetyzowanej nici, nie powstaje pirofosforan i nie obserwujemy sygnału świetlnego. Zależność ta umożliwia bezpośrednie określenie sekwencji DNA.

4. ATP, który nie został zużyty w reakcji oraz niekomplementarne trifosforany deoksyrybonukleozydów zostają przekształcane w monofosforany przez apirazę, by móc dodać do mieszaniny reakcyjnej kolejny trifosforan.

np. GTP -> GMP + 2Pi

Zalety

Przede wszystkim analizy z zastosowaniem pirosekwencjonowania charakteryzuje wysoka czułość, wiarygodność, powtarzalność wyników (dokładność powyżej 99%) oraz specyficzność. Dzięki użyciu zdefiniowanych starterów powielony i poddany analizie zostaje jedynie wybrany fragment DNA. Otrzymywany wynik jest nie tylko jakościowy, ale także ilościowy, co ważne jest w przypadku analizy heterozygotyczności, zmian metylacji, czy chimeryzmu. Dzięki pominięciu etapu rozdziału elektroforetycznego, analiza przebiega znacznie szybciej (~10 minut) w porównaniu z konwencjonalnym sekwencjonowaniem Sangera (24-55h). Cechuje ją też dobra wydajność, wynikająca z zastosowania 96-dołkowej płytki. Niewątpliwym plusem przedstawianej technologii jest też wysoki stopień automatyzacji - proces dodawania nukleotydów i analizy wyników wykonywany jest przez urządzenie. Zadanie człowieka stanowi jedynie przygotowanie próbki.

Wady

Podstawowym problemem związanym z pirosekwencjonowaniem jest niewielka długość odczytywanych fragmentów DNA. Wynosi ona średnio ok. 300-500 pz, podczas gdy popularna metoda dideoksy Sangera pozwala na determinację kolejności 1000 pz. Znacznie utrudnia to analizę bioinformatyczną - składanie całych genomów czy poszukiwanie "białek podobnych".

Drugą istotną słabością  opisywanej techniki jest niemożność sekwencjonowania rejonów homopolimerycznych dłuższych niż 7-8 nukleotydów. Okazuje się bowiem, iż  w momencie wbudowania większej ilości nukleotydów tego samego rodzaju uzyskiwany sygnał świetlny traci proporcjonalną zależność.

Zastosowania pirosekwencjonowania:

Aplikacje pirosekwencjonowania są liczne. Technika ta służyć może detekcji mutacji oraz polimorfizmów, np. polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP- ang. Single Nucleotide Polymorphism) i związanych z nimi chorób genetycznych. Ponadto może być stosowana do identyfikacji mikroorganizmów, zarówno w sytuacjach klinicznych (diagnostyka patogenów) jak i zastosowaniach systematycznych.

Pirosekwencjonowanie okazuje się przydatne  także w analizie ekspresji genów oraz badaniach epigenetycznych. Umożliwia określanie zmian metylacji oraz identyfikację wysp CpG.

Dzięki wysokiej czułości opisywana technologia ma również swoje miejsce w kryminalistyce (analiza mikrośladów). Poza tym stanowi podstawę dla platformy sekwencjonowania wysokoprzepustowego "454" oferowanej przez firmę Roche.

Literatura:

  1. Metzker ML (2005) Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15:1767-1776.
  2. Ronaghi M (2001) Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res. 11:3-11.
  3. Ronaghi M, Karamohamed S, Pettersson B, Uhlen M, Nyren P (1996) Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242:84–89.
  4. Ronaghi M, Uhlen M, Nyren P (1998) A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281:363–365.

Przeczytaj również artykuły na temat: ELISA, Real- time PCR, PCR, Western blot, Mikromacierze.

ISSN 1689-7730